Khi người anh Ludvig của ông qua đời vào năm 1888, nhiều vụ cáo phó sớm nhầm lẫn về cái chết của Alfred Nobel, được cho là điều khiến ông quyết định để lại một di sản tốt hơn cho thế giới sau khi chết. Bản cáo phó trên một tờ báo Pháp viết Le marchand de la mort est mort (Nhà buôn cái chết đã chết) và tiếp tục viết, "Tiến sĩ Alfred Nobel, người đã trở nên giàu có sau khi phát minh ra cách thức giết con người nhanh chóng hơn bao giờ hết, đã qua đời ngày hôm qua."

Ngày 27 tháng 11 năm 1895 tại Câu lạc bộ Thuỵ Điển – Na Uy ở Paris, Nobel đã ký chúc thư cuối cùng của mình và để phần lớn số tài sản thành lập các giải Nobel, trao hàng năm cho bất kỳ ai không phân biệt quốc tịch. Ông qua đời sau một cơn đột quỵ ngày 10 tháng 12 năm 1896 tại Sanremo, Ý. Số lượng tiền mặt dành cho Quỹ Giải Nobel là 31 triệu kronor (4.223.500,00 USD), 94% tài sản của Nobel.

Ba giải Nobel đầu tiên dành cho những gương mặt nổi bật trong khoa học vật lý, trong hoá học và trong Giải Nobel Sinh lý học hay Y học; giải thứ tư là dành cho các nhà văn có tác phẩm văn học "theo một định hướng tư tưởng" và giải thứ năm được trao cho cá nhân hay tổ chức có được thành tích tốt nhất phục vụ lý tưởng cho tình thân thiện quốc tế, ngăn chặn hay giảm bớt các đội quân thường trực, hay thành lập hay xúc tiến sự tiến triển của hoà bình.

Định nghĩa giải văn học, "theo một định hướng tư tưởng" (tiếng Thuỵ Điển: i idealisk riktning), khá khó hiểu và gây ra nhiều tranh cãi. Trong nhiều năm, Viện Hàn lâm Thuỵ Điển diễn giải "ideal – tư tưởng" mang nghĩa "duy tâm hay lý tưởng" (trong tiếng Thuỵ Điển idealistisk), và coi đó là lý do để từ chối trao giải cho những tác giả quan trọng nhưng kém phần lãng mạn, như Henrik Ibsen, August Strindberg và Lev Nikolayevich Tolstoy. Cách hiểu này đã được thay đổi và ví dụ, giải thưởng đã được trao cho Dario Fo và José Saramago, những người hoàn toàn không thuộc trường phái văn học duy tâm (hay lý tưởng).

Khi đọc cuốn Nemesis trong nguyên bản tiếng Thuỵ Điển và khi nhìn vào triết thuyết cũng như quan điểm văn học của ông, dường như ông có ý chống lại điều từng tin tưởng lúc đầu - rằng giải thưởng phải được trao cho các tác giả đã chiến đấu cho lý tưởng của mình "chống lại" những quyền lực như Chúa, Nhà thờ và Quốc gia.

Các cơ quan được ông chỉ định trao giải thưởng vật lý và hoá học cũng có khá nhiều cách diễn giải ý kiến của ông, bởi vì ông không tham vấn ý kiến của họ trước khi quyết định uỷ thác trách nhiệm. Trong một bản chúc thư dài một trang ông đặt điều kiện rằng số tiền không được trao cho những khám phá hay phát minh trong khoa học vật lý và những khám phá hay những cải tiến trong hoá học. Ông đã mở một cảnh cửa cho những giải thưởng kỹ thuật, nhưng ông không để lại những hướng dẫn về việc làm cách nào phân biệt giữa khoa học và kỹ thuật. Bởi vì các cơ quan có quyền quyết định trao giải trong những lĩnh vực đó quan tâm nhiều tới khoa học hơn kỹ thuật nên không ngạc nhiên các giải thưởng đều được trao cho những nhà khoa học chứ không phải các kỹ sư, kỹ thuật viên hay những nhà phát minh khác. Theo một nghĩa các giải thưởng được công bố gần đây của World Technology Network là một sự tiếp nối không trực tiếp (bởi vì không phải do Quỹ Nobel tạo ra) những ước vọng của Nobel, bởi vì ông đã không ghi điều đó vào trong di chúc của mình.

Năm 2001, cháu trai của ông, Peter, đã yêu cầu Ngân hàng Thuỵ Điển phân biệt giải thưởng dành cho các nhà kinh tế học của họ được trao "để tưởng nhớ Alfred Nobel" với năm giải thưởng kia. Điều này đã gây ra nhiều tranh cãi về việc liệu giải thưởng trao trong lĩnh vực kinh tế hiện nay có phải là "Giải Nobel" hay không (xem Giải thưởng Khoa học kinh tế của Ngân hàng Thuỵ Điển để tưởng nhớ Alfred Nobel).